HPLC色譜應(yīng)用的經(jīng)典案例分析

HCS和ACRP的經(jīng)典案例分析

應(yīng)用原理：利用陰陽(yáng)離子交換或者排斥做保留，然后通過(guò)分析物的親水差異把它們洗脫下來(lái)。

使用HCS分離多種糖

由上圖可以看出，其四個(gè)的羥基pka最小都在11左右，所以在酸性的條件下并不存在電離的情況，不能使用陰陽(yáng)離子交換或者排斥作用。

只能通過(guò)親水性和氫鍵作用把他們分開(kāi)，由于果糖和葡萄糖都是5個(gè)羥基，只是位置不同，所以在圖譜里可以看到，兩個(gè)峰是距離很近的。

由上面幾個(gè)圖可以看到，四個(gè)氨基酸他們都有一個(gè)氨基的pka在9左右，也就是說(shuō)ph低于7都有電離，而且他們也都有一個(gè)羥基的pka在2左右，所以ph大于4左右也會(huì)有電離，所以當(dāng)使用的緩沖鹽的ph等于5時(shí)，可以使用陽(yáng)離子交換和陰離子排斥的作用，同時(shí)也可以使用氫鍵的作用作為保留。再根據(jù)他們的親水性不同，將他們分開(kāi)。

四丁基銨離子比溴離子和氯離子先出峰峰可能的原因是分析物的疏水性太強(qiáng)，緩沖鹽ph=3，導(dǎo)致固定相上的電離不夠，從而陽(yáng)離子交換作用也不強(qiáng)，導(dǎo)致在Hilic模式里沒(méi)什么保留。

當(dāng)緩沖鹽的PH用到了5，觀(guān)察第一個(gè)圖譜和條件，四丁基銨離子因?yàn)橹挥幸粋€(gè)位點(diǎn)的陰陽(yáng)離子交換，該流動(dòng)相條件下幾乎沒(méi)有沒(méi)有Hilic作用，導(dǎo)致出峰最慢。此PH狀態(tài)下，甜菜堿具有兩個(gè)位點(diǎn)的電離，陰陽(yáng)離子交換比較強(qiáng)，所以最先出峰。觀(guān)察第二個(gè)圖譜和條件，此時(shí)的流動(dòng)相條件下具有Hilic作用，又因?yàn)樗亩』@離子是分析物中疏水性最強(qiáng)的，所以最先出峰。

該流動(dòng)相條件下只使用了陰陽(yáng)離子的交換作用，分離分析物，緩沖鹽的PH設(shè)置到5，可能是為了讓固定相有足夠的電離，更好將鈉離子和鉀離子分離開(kāi)來(lái)。